磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

（ Phosphorescent Carboxylase，分光光度法 50T/48樣）

一、測定原理

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸

和磷酸氫離子，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH

生成蘋果酸和NAD +，在340nm測定NADH減少速率，從而計

算PEPC活性。

二、自備儀器用品

臺式離心機(jī)、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、移液

槍、研缽、冰和蒸餾水

三、試劑組成和配制

提取液：60mL×1 瓶, 4℃保存

試劑一：30mL×1 瓶，4℃保存

試劑二：10mL×1 瓶，4℃保存

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前加4mL蒸餾水充分

溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加5mL蒸餾水充分

溶解，用不完的分裝后-20℃保存（禁止反復(fù)凍融）。

試劑五：原液20μL×1 支，4℃保存

試劑五：稀釋液10mL×1 瓶，4℃保存

四、樣品前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心

后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4個）：提取液體積

（mL）500-1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入

1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％

或200W，超聲3s，間隔10 秒，重復(fù)30 次）；在4°C下

8000g離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)1：5~10 的

比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰

浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測

五、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，用蒸

餾水調(diào)零。

2. 試劑五工作液的配置：將試劑五原液：試劑五稀釋液

=1:329稀釋，用多少配多少。

3. 將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于37°C（哺乳

動物）或25°C（其他物種）預(yù)熱5分鐘。

六、測定意義

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）廣泛存在于動物、植物、

微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化

碳反應(yīng)生成草酰乙酸不可逆反應(yīng)的酶，對三羧酸循環(huán)的運(yùn)

轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

七、PEPC活性計算

1 血清（漿）活力的計算

單位的定義：每mL 血清（漿）在每分鐘消耗1nmol NADH

定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/mL) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷V樣÷T

=1624×△A

2 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計算

（1）按組織蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH

定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(Cpr×V)÷T

=1624×△A÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為

一個酶活力單位。

PEPC(U/g) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(W×V 樣÷V樣總)÷T

=1624×△A÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol

NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/10 4 cells) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=3.248×△A

ε：NADH在340nm 處摩爾吸光系數(shù)為6.22×10 3L/mol/cm；

d ：比色皿光徑（cm），1cm；

V反總：反應(yīng)體系總體（L），1010μL=1.01×10 -3L；

10 9：1mol=1×10 9nmol；

Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；

V樣總：加入提取液體積，1mL

T：催化反應(yīng)時間（min），5min。

W，樣本質(zhì)量，（g）。

500： 細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

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