生物通報道 ：隨著測序成本的直線下降，解讀一個生物的基因組正在逐漸成為研究者們的日常工作。然而，并不是細胞都能夠達到測序要求，測序一般需要幾千到一百萬細胞。舉例來說，如果你研究的是早期胚胎發(fā)育，那么可用的細胞數(shù)量就很少，在這種情況下每一個細胞都很寶貴。

The Scientistzui近撰文詳細介紹了單細胞表觀遺傳學(xué)研究中的一些關(guān)鍵技術(shù)。這些技術(shù)可以幫助我們在單個細胞中檢測DNA、組蛋白和染色質(zhì)水平上的表觀遺傳學(xué)修飾。

染色質(zhì)水平的改變

高等生物的細胞核負責(zé)儲存基因組DNA，這些DNA環(huán)繞著由四種組蛋白組成的八聚體，形成碟狀的核小體結(jié)構(gòu)?；蚪MDNA以這樣的形式包裝成為染色質(zhì)，使DNA受到良好的保護。

控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白，都要結(jié)合在DNA上起作用。而染色質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)會隨著細胞生活周期而變化，調(diào)節(jié)調(diào)控因子所能接觸到的基因。

人們一般使用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)，在細胞群體中研究染色質(zhì)水平上的改變。但這種技術(shù)只能給出平均的3D結(jié)構(gòu)，“你無法了解單細胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，”劍橋大學(xué)的Ernest Laue教授說。Laue教授之前參與的一項研究就解決了這個問題，找到了在單細胞中對染色質(zhì)彎曲和折疊進行定量的方法。這個方法主要是Babraham 研究所的Takashi Nagano開發(fā)的，他成功將傳統(tǒng)Hi-C的基礎(chǔ)步驟應(yīng)用到了單細胞中。研究人員在單個細胞的細胞核中交聯(lián)染色質(zhì)以保持環(huán)的形態(tài)，用酶消化掉非交聯(lián)的染色質(zhì)，然后連接自由末端并進行測序，在。（延伸閱讀：Nature揭示染色體真實面貌）

進行這樣的微量操作，需要我們在細節(jié)處理上一絲不茍。據(jù)Laue介紹，目前只有Nagano總能獲得一致性的實驗結(jié)果。此外，測序后的計算分析也是這個方法的關(guān)鍵所在，因為DNA擴增會帶來許多噪音信號。

揭露組蛋白上的修飾

細胞中的表觀遺傳學(xué)改變也發(fā)生在組蛋白水平上，比如甲基化、乙?；土姿峄，F(xiàn)在人們已經(jīng)找到了在單細胞中成像組蛋白修飾的方法。美國弗吉尼亞大學(xué)的Delphine Gomez和Gary Owens合作，通過熒光探針和原位雜交分析了平滑肌細胞里的組蛋白修飾。他們對鄰位連接檢測進行了改良，利用二抗點亮存在表觀遺傳學(xué)修飾的組蛋白。雖然這一方法只能用于固定了的組織，但在不同發(fā)育階段對細胞進行檢測，可以揭示隨著時間推移而發(fā)生的改變。（原文連接：Nat Methods, 10:171-77, 2013,）

如果你需要檢測活組織中的組蛋白表觀遺傳學(xué)修飾，你可以參考Kazuki Sasaki等人開發(fā)的檢測技術(shù)。這個RIKEN團隊在熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET的基礎(chǔ)上構(gòu)建了新型感應(yīng)器，以監(jiān)控特定組蛋白殘基上的乙?；?。他們開發(fā)的探針稱為Histac，主要適用兩種熒光蛋白夾著一個組蛋白和一個能識別組蛋白乙酰化的溴區(qū)結(jié)構(gòu)域(Bromodomain)。當(dāng)乙?；淮嬖跁r，Histac感應(yīng)器會生成的熒光信號。當(dāng)組蛋白被乙?；臅r候，構(gòu)象改變會拉開兩個FRET元件的距離，生成較弱的熒光信號。研究人員用這個技術(shù)觀察了有絲分裂過程中的組蛋白乙酰化改變。不過Sasaki等人提醒道，目前這種探針需要向細胞中引入外源組蛋白，有改變細胞基因表達的可能。未來的新一代的Histac探針將會避免這一問題。

前景展望

對于前文提到的單細胞表觀遺學(xué)研究方法而言，污染問題都是重中之重，因為這類實驗的樣本和試劑量都很小。如果你的DNA樣本很多，那么擴增步驟通常能蓋過污染。但對于單細胞研究來說，“整個流程的每一步都有可能引入污染，破壞掉真實的信息，”Kelsey說。“我們可以參照二三十年前做PCR時的那些注意事項。”

研究者們普遍認為，單細胞表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的下一步發(fā)展，是將多種研究方法的結(jié)合起來使用。在未來幾個月或者幾年里，我們將會看到能在單個細胞中同時檢測轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的技術(shù)。深入了解更多的單細胞信息，可以幫助人們理解不同細胞之間的差異，以及這些差異對發(fā)育或疾病狀態(tài)所產(chǎn)生的影響。

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