己糖激酶(HK)試劑盒

(分光光度法 50 管/48 樣)

一、測定意義：

己糖激酶(Hexokinase, HK )(EC 2.7.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過程中的第一個關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。

二、測定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成

NADPH,NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

三、自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

四、試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；×

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 30mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4 度保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 2mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 250μL 試劑一和 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

五、樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4）：提取液體積（mL）為 500-1000:1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20%或 200W，超聲 3S,間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議稱取 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

六、測定步驟：

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三、四和五 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）預(yù)熱 10 分鐘。

注意事項(xiàng)：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、五和六按照比例配成混合液，預(yù)熱 10min。

2、不同勻漿組織中的 HK 活力不一樣，做正式實(shí)驗(yàn)之前請做 1-2 只預(yù)試，若△A>0.5，則說明組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時間至 2min，使△A<0.5，以提高檢測靈敏度。

 己糖激酶(HK)試劑盒