產(chǎn)品名稱：大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒

英文名稱：Rat TNF-α ELISA Kit Instruction

規(guī)格：48T/96T

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹-底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

4.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

注：

1.  標準品濃度依次為：320、160、80、40、20、10 pg/mL

2.  經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過標準品濃度時，可用樣本-稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

操作注意:

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。所有液體組分使用前充分搖勻。

2. 洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑的準備

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。

2. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本50μL，空白孔不加；

4.  除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結(jié)果計算:

以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1. 檢測范圍：10 pg/mL – 320 pg/mL。

2.  靈敏度：最-低檢測濃度小于1.0 pg/mL。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。

    重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15%

其他注意事項:

1. 最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關，請務必準備充足的標本備份。

2. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商或者不同批次的產(chǎn)品。嚴格遵守試劑盒的實驗說明才會得到的檢測結(jié)果。

3. 本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

4. 使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質(zhì)的引入導致ELISA實驗結(jié)果偏差。

5. 若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

6. 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。

操作安全須知:

1) 所有的化學試劑理應被認為具有潛在危害,任何的操作都必須提前做好實驗防護。在操作試劑盒或處理樣本的區(qū)域請不要飲食。

2) 推薦只有經(jīng)過良好實驗室培訓的工作人員方可操作本試劑盒。操作時請佩戴合適的防護設施，例如白大衣、實驗手套、安全眼鏡等。

3) 請不要讓試劑或樣本接觸皮膚、眼睛和粘膜等身體部位。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

4) 試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，做好防護眼睛、手及面部等的措施。 

5)檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照實驗室規(guī)定進行處置，嚴禁隨意丟棄。

6)試劑盒的液體組分中，含有防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧或與皮膚接觸。底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后徹-底洗手。

免責聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2.   嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。

大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒