ELISA實(shí)驗(yàn)代測(cè)篇：標(biāo)本和溫育對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 因其操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好，經(jīng)濟(jì)安全等特點(diǎn)而在上廣泛應(yīng)用，但是由于其操作步驟復(fù)雜，一般包括試劑準(zhǔn)備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結(jié)果判定等，其中任何一項(xiàng)操作不當(dāng)都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生很大影響。因此，必須加強(qiáng)ELISA檢測(cè)的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

標(biāo)本

患者標(biāo)本中有可能含有干擾試驗(yàn)的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過(guò)選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及標(biāo)本凝固等。要注意避免標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血，標(biāo)本中血紅蛋白中含有血紅素基因，其具有類過(guò)氧化物的活性，因此，在以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）為標(biāo)記的ELISA測(cè)定試驗(yàn)中，容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與加入的底物反應(yīng)顯色。標(biāo)本在低溫下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。通常血清標(biāo)本可在2～8℃保存1 周，冷凍保存時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽(yáng)性結(jié)果。冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融，標(biāo)本的反復(fù)凍融會(huì)因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價(jià)下降從而引起假陰性結(jié)果。標(biāo)本的采集及分離要注意盡量避免細(xì)菌的污染。此外，標(biāo)本在凍存時(shí)會(huì)因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標(biāo)本必須混勻，但不要?jiǎng)×艺袷幒头磸?fù)顛倒。

加樣　

加樣器是一種比較精密的工具，其在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或推動(dòng)桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對(duì)加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標(biāo)本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡，加樣時(shí)還應(yīng)注意操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響，尤其對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)結(jié)果影響更大。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時(shí)用多道加液器，或者雙人同時(shí)加樣以減少操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響，另外有些項(xiàng)目在檢測(cè)前需要稀釋以減少非特異性反應(yīng)。稀釋的方式非常重要，佳方式是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。

溫育

溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適反應(yīng)溫度?？乖贵w反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2 h 產(chǎn)物的生成可達(dá)，為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過(guò)程中連續(xù)振蕩來(lái)增加抗原抗體接觸的概率?？乖贵w反應(yīng)在4℃更為*，形成的產(chǎn)物更多、更穩(wěn)定，但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA檢測(cè)中一般不予采用。

溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（即“邊緣效應(yīng)”）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過(guò)程中每塊反應(yīng)板不能重疊放置，防止溫度擴(kuò)散的不均勻性。

綜上所述，ELISA檢測(cè)操作步驟復(fù)雜，可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素較多，分布在測(cè)定操作的各個(gè)步驟中，因此必須加強(qiáng)各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，才能得到準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。

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