免疫組化染色基本技術及注意事項

1．實驗計劃

① 根據課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無 交叉，則不能用其他 動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復合物。

② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面貼于同一張載片上，否則無可比性。

③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。

2．Ab稀釋度 （如系購買的藥盒有工作液和原液）

（1）工作液：無須稀釋

（2）原液：

① 應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。

如：工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗；

若: 1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。

② 原液的保存（—20℃）凍存——應選稀度凍存。

③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20 ℃）于 冰箱備用。

④ 關于Ab保存應參照說明書。

（3）Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行，若一方過剩則形成復合物小且少；極 過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現假陰性。——并非Ab濃度越高越好。

3．Ab滴片技術

—— 所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。

[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要領：甩凈組織周圍的水。

4．PBS洗滌技術

（1）洗滌的目的

① 保證離子濃度和PH值。

② 減少非特異反應（平時Ab不可靠很純）

（2）方法：洗三次，每次5分鐘。

5．Ab孵育技術

（1）必須在濕盒內進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。

（2）溫度與時間 4℃：過夜；

37℃：2 h or 參考說明書

6．光鏡控制顯色方法

（1）室內操作：注意溫度與時間的關系，室溫zui宜5分鐘。

（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。

對照組和染色結果的評價

從以下幾 個方面綜合評價：

1．陽性染色特點

① Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。（非特異性～細胞與組織無區(qū)別）

② 染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）

2．組織切片制作過程的影響

① 固定不良—非特異性染色，顯示不均。

② 邊緣干燥—非特異性染色（常見），加抗體時勿干片。

3．人工假象與特異性結果顯示不在同一平面上。

陽性對照：

用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色。對照切片呈陽性結果，標為陽性對照。

陰性對照：

用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照 還應包括空白、替代、吸收和抑制實驗。

▲ 染色失敗的幾種原因：

（1）所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性 對照在內。全部（－）原因可能：

① 染色未*嚴格按照操作步驟進行；

② 漏加一種抗體，或抗體失效；

③ 緩沖液內含*，抑制了酶的活性；

④ 底物中所加H2O2 量少或失效；

⑤ 復染或脫水劑使用不當

（2）所有切片均呈陽性反應，原因可能是：

① 切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。

② 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準確，洗滌不*。

③ 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長。

④ 抗體溫育的時間過長。

⑤ H2O2 濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。

（3）所有切片背景過深，原因可能是：

① 未加酶消化處理切片。

② 切片或涂片過厚。

③ 漂洗不夠。

④ 底物呈色反應過久。

⑤ 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。

⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。

（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。

zui常見的原因是：標本的固定和處理不當。

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