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人分泌型免疫球蛋白A(SIgA)酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
*部分ELISA 簡介
ELISA 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。自上
世紀70 年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。
ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原
或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。
在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗
滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗
原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一
定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)
的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地
放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。
第二部分ELISA 的樣本實驗準備
在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后
當天就進行檢測的樣本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?。對于隔天再檢測的樣本，及時分裝后凍存在-
20℃?zhèn)溆?，有條件的，-70℃凍存?zhèn)溆?。標本應避免反復凍融?br />液體類標本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集
上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離
心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再
次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細收集上清。
5. 培養(yǎng)細胞：檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100
萬/ml 左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。
離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再
次離心。
6. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?br />標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑，
用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。
分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
7. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進
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行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
8. 不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
第三部分ELISA 試劑盒的檢測目的和實驗原理
1.檢測目的
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量。
2.實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人分泌型免疫球蛋白A(SIgA)水平。用純化的人分泌
型免疫球蛋白A(SIgA)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入分泌
型免疫球蛋白A(SIgA)，再與HRP 標記的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)抗體結(jié)合，形成抗體-抗
原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，
并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)呈正相
關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中人分泌型免
疫球蛋白A(SIgA)濃度。
第四部分試劑盒組成
試劑盒組成48T 96T 保存
說明書1 份1 份
封板膜2 片（48） 2 片（96）
密封袋1 個1 個
酶標包被板1×48 1×96 2-8℃保存
標準品（32μg/ ml） 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存
標準品稀釋液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存
酶標試劑3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
樣品稀釋液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
顯色劑A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
顯色劑B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
終止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存
濃縮洗滌液
(20 倍)20ml×1
瓶
(30 倍)20ml×1
瓶
2-8℃保存
第五部分操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
16μg/ ml 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
8μg/ ml 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
4μg/ ml 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2μg/ ml 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
1μg/ ml 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
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2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待
測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl， 然
后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液
后15 分鐘以內(nèi)進行。
12. 操作程序總結(jié)：
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第六部分計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值
由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；
或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的
直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，
計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為樣品
的實際濃度。
（此圖僅供參考）
第七部分注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值
大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
第八部分檢測范圍
0.3μg/ ml -16μg/ ml
第九部分保存條件及有效期
1．試劑盒保存：2-8℃
2．有效期：6 個月