高鐵血紅蛋白（MetHb）測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)

一、實(shí)驗(yàn)儀器：試管、微量移液器、旋渦混勻器、可見(jiàn)分光光度計(jì)（540、602和630nm）

二、適用范圍：本試劑盒可測(cè)各種動(dòng)物全血等樣本中高鐵血紅蛋白含量；

三、測(cè)定意義：體內(nèi)一氧化氮彌散入血后，很快與氧合血紅蛋白結(jié)合形成高鐵血紅蛋白（methemoglobin, MetHb），NO與MetHb變化相關(guān)，故全血MetHb檢測(cè)近年來(lái)受到的廣泛重視。同時(shí)血液中高鐵血紅蛋白含量的測(cè)定對(duì)接觸芳香族氨基、硝基化合物所引起的中毒性疾病的診斷與治療，有重要的意義。

四、試劑組成及配制：

     A.試劑一：血紅蛋白測(cè)定濃縮液，1ml X 2支,2—8℃保存。

               血紅蛋白測(cè)定應(yīng)用液的配制：臨用前將濃縮液用雙蒸水1:99稀釋?zhuān)?00倍稀釋?zhuān)F(xiàn)用現(xiàn)配。配好的試劑2—8℃避光保存，可存放一個(gè)月以上。

     B.試劑二: 高鐵血紅蛋白測(cè)定濃縮液，30ml X 1瓶，2—8℃。

              高鐵血紅蛋白測(cè)定應(yīng)用液的配制：  濃縮液:雙蒸水=1:9稀釋?zhuān)?0倍稀釋?zhuān)纱娣?個(gè)月以上。

     C.試劑三：制作還原血紅蛋白曲線用

              ① 白色粉劑 X 1支，2—8 ℃避光保存。

              ② 稀釋液，1ml X 1支，2—8 ℃保存。

              試劑三應(yīng)用液配制：臨用前每支粉劑加入1ml稀釋液，現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光。

     D.試劑四：制作高鐵血紅蛋白曲線用

              ① 磚紅色粉劑 X 1支，2—8℃避光保存。

              ② 稀釋液，1ml X 1支，2—8℃保存。

              試劑四應(yīng)用液配制：臨用前每支粉劑加入1ml稀釋液，現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光

五、操作過(guò)程：

1、制備抗凝全血：取全血立即加入到肝素抗凝管內(nèi)，加蓋封口，輕輕顛倒混勻。

2、血紅蛋白含量的測(cè)定：取 0.01ml 全血與 2.5ml 的 100 倍稀釋的試劑一應(yīng)用液（血紅蛋白測(cè)定應(yīng)用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，540nm處測(cè)定各管吸光度值。

3、高鐵血紅蛋白測(cè)定： 取0.05ml全血，加入2.5ml的試劑二稀釋?xiě)?yīng)用液（即高鐵血紅蛋白測(cè)定應(yīng)用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定630nm處及602nm處吸光度值。如果沒(méi)有雙波長(zhǎng)的分光光度計(jì)則可以先測(cè)定各管630nm處吸光度值，然后再測(cè)各管602 nm處吸光度值。但一定要注意各管的編號(hào)不要弄錯(cuò)。

六、計(jì)算公式：

①、血紅蛋白含量的計(jì)算：血紅蛋白克數(shù)/升=540nm處吸光度值×367.7

②、高鐵血紅蛋白百分比計(jì)算： MetHb% = (A630nm—r x A602nm)÷(A602nm x(R— r)) ×100%

③、高鐵血紅蛋白含量的計(jì)算：高鐵血紅蛋白克數(shù) /升 = MetHb%×血紅蛋白克數(shù)/升

【注1】 A630即在630nm波長(zhǎng)時(shí)樣本的吸光度值；A602即在602nm波長(zhǎng)時(shí)樣本的吸光度值

【注2】 R與r均為常數(shù)，R=1.81；r=0.14。（本研究所測(cè)定常數(shù)）

即計(jì)算公式可以簡(jiǎn)化為：

①、高鐵血紅蛋白百分比： MetHb% = (A630nm—0.14×A602nm) ÷(A602nm ×1.67) ×100%

②、高鐵血紅蛋白含量的計(jì)算：高鐵血紅蛋白克數(shù)/升 = MetHb%×血紅蛋白克數(shù) /升

七、計(jì)算舉例：

①、取吸煙人全血，立即加入到肝素抗凝管，加蓋封口，輕輕顛倒混勻。

②、取該全血0.01ml與2.5ml的100倍稀釋的試劑一應(yīng)用液（血紅蛋白測(cè)定應(yīng)用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定吸光度值為0.373，則通過(guò)公式可計(jì)算出血紅蛋白含量。

    血紅蛋白含量計(jì)算：血紅蛋白克數(shù)/升=540nm處吸光度值x 367.7 =0.373 X367.7=137.15克/升

③、再取該全血0.05ml，加入2.5ml的試劑二稀釋?xiě)?yīng)用液(即高鐵血紅蛋白測(cè)定應(yīng)用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)得602nm處的吸光度值為0.226,測(cè)定管630nm處的吸光度值為0.066，通過(guò)公式可計(jì)算出高鐵血紅蛋白百分比：

高鐵血紅蛋白百分比計(jì)算：MetHb%=(A630nm- r×A602nm)÷(A602nm x(R- r)) ×100%

=(0.066-0.14x0.226)÷(0.226x1.67)x100%=9.10%

高鐵血紅蛋白含量的計(jì)算：高鐵血紅蛋白克數(shù)/升= MetHb%X血紅蛋白克數(shù)/升

                                          =0.091x137.15克/升=12.486克/升

八、注意事項(xiàng)：

①、取血后應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，否則影響測(cè)定結(jié)果，因?yàn)榧t細(xì)胞中的還原酶可使高鐵血紅蛋白逐漸還原，使結(jié)果降低。但可放-20℃以下冷凍保存，如果血樣較多，可將全血分成幾小管，每次測(cè)試可取其一小管，每次測(cè)試可取其一小管，余下各管仍保存-20℃以下以備重復(fù)測(cè)試，其結(jié)果不受影響。

②、本實(shí)驗(yàn)可用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定，可同時(shí)測(cè)定602nm處及630nm處吸光度值，進(jìn)行計(jì)算。也可用單波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定，可以先測(cè)定各管630nm處吸光度值，然后再測(cè)各管602nm處吸光度值。但一定要注意各管的編號(hào)不要弄錯(cuò)。

③如果實(shí)驗(yàn)室分光光度計(jì)沒(méi)有雙波長(zhǎng)掃描功能，可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接用本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。R與r均為常數(shù)，R=1.81;r=0.14

4所用器皿要干凈。