教你如何計(jì)數(shù)霉菌酵母菌

檢驗(yàn)方法




霉菌和酵母的計(jì)數(shù)方法，與菌落總數(shù)的測(cè)定方法基本相似。主要步驟為：
將樣品制作成10倍梯度的稀釋液，選擇2~3個(gè)合適的稀釋度，分別吸取1 mL于兩個(gè)無(wú)菌平皿，傾注培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察，計(jì)數(shù)。
對(duì)番茄醬、番茄汁適用于第二法 霉菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法，是采用顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)的方法。這個(gè)方法表達(dá)的是該食品是否存在加工前的腐-敗。


具體檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)按照：
GB 4789.15－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　霉菌和酵母計(jì)數(shù)》
 

真菌和酵母的介紹

酵母是真菌中的一大類(lèi)，通常是單細(xì)胞，呈圓形、卵圓形、臘腸形或桿狀。

霉菌也是真菌的一種。一般把能夠形成疏松的絨毛狀菌絲體的小型真菌稱(chēng)為霉菌。

霉菌和酵母廣泛分布于自然界并可作為食品中正常菌相的一部分。以來(lái)，人們利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鮮美；還可利用霉菌和酵母釀酒、制醬；食品、化學(xué)、醫(yī)藥等工業(yè)都少不了霉菌和酵母。


但在某些情況下，霉菌和酵母也可造成食品腐-敗變質(zhì)。由于它們生長(zhǎng)緩慢和競(jìng)爭(zhēng)能力不強(qiáng)，故常常在不適于細(xì)菌生長(zhǎng)的食品中出現(xiàn)，這些食品是pH低、濕度低、含鹽和含糖高的食品、低溫貯藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗冷凍，以及抗生素和輻照等貯藏及保藏技術(shù)，它們能轉(zhuǎn)換某些不利于細(xì)菌的物質(zhì)，而促進(jìn)致病細(xì)菌的生長(zhǎng)；有些霉菌能夠合成有毒代謝產(chǎn)物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鮮的和加工的食品中繁殖，可使食品發(fā)生難聞的異味，它還可以使液體發(fā)生混濁，產(chǎn)生氣泡，形成薄膜，改變顏色及散發(fā)不正常的氣味等 。


因此霉菌和酵母也作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌，并以霉菌和酵母計(jì)數(shù)來(lái)表示食品被真菌污染的程度。目前已有若干個(gè)國(guó)家制訂了某些食品的霉菌和酵母*。我國(guó)已制訂了一些食品中霉菌和酵母的*。




霉菌菌絲的特征：

平行壁：霉菌菌絲呈管狀，多數(shù)情況下，整個(gè)菌絲的直徑是一致的。因此在顯微鏡下菌絲壁看起來(lái)象兩條平行的線(xiàn)。這是區(qū)別霉菌菌絲和其他纖維時(shí)zui有用的特征之一。

橫隔：許多霉菌的菌絲具有橫隔，僅有毛霉、根霉等少數(shù)霉菌的菌絲沒(méi)有橫隔。

菌絲內(nèi)呈粒狀：薄壁、呈管狀的菌絲含有原生質(zhì)，在高倍顯微鏡下透過(guò)細(xì)胞壁可見(jiàn)其呈粒狀或點(diǎn)狀。

分枝：如菌絲不太短，則多數(shù)呈分枝狀，分枝與主干的直徑幾乎相同，有分枝是鑒定霉菌菌絲的可靠特征之一。

菌絲的頂端：常呈鈍圓形，無(wú)折射現(xiàn)象。



凡有以上特征之一的絲狀均可判定為霉菌菌絲。



觀察視野中有無(wú)菌絲，凡符合下列情況之一者為陽(yáng)性視野。   

一根菌絲長(zhǎng)度加上分枝的長(zhǎng)度超過(guò)視野直徑1/6；

一根菌絲長(zhǎng)度超過(guò)視野直徑1/6；   

兩根菌絲總長(zhǎng)度超過(guò)視野直徑1/6；  

三根菌絲總長(zhǎng)度超過(guò)視野直徑1/6；  

一叢菌絲可視為一個(gè)菌絲，所有菌絲（包括分枝）總長(zhǎng)度超過(guò)視野直徑1/6。



根據(jù)對(duì)所有視野的觀察結(jié)果，計(jì)算陽(yáng)性視野所占比例，并以陽(yáng)性視野百分?jǐn)?shù)（%）報(bào)告結(jié)果。


說(shuō) 明



1．樣品的處理：為了準(zhǔn)確測(cè)定霉菌和酵母數(shù)，真實(shí)反映被檢食品的衛(wèi)生質(zhì)量，首先應(yīng)注意樣品的代表性。容易混勻的液體樣品可用迅速振搖樣品稀釋液容器25次來(lái)混勻。



對(duì)大的固體食品樣品，要用滅菌刀或鑷子從不同部位采取試驗(yàn)材料，再進(jìn)行均質(zhì)。如樣品不太大，zui-好把全部樣品放到拍擊式均質(zhì)器內(nèi)均質(zhì)1 min。由于霉菌絲狀結(jié)構(gòu)的特性，使用旋轉(zhuǎn)刀均質(zhì)器可能會(huì)導(dǎo)致較高的不真實(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果。



2．樣品的稀釋?zhuān)?值較嚴(yán)格的樣品，可以直接取原液進(jìn)行檢驗(yàn)。為了減少稀釋倍數(shù)的誤差，在連續(xù)遞增稀釋時(shí)，每一稀釋度應(yīng)更換一根吸管。以前標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在稀釋過(guò)程中，為了使霉菌的孢子充分散開(kāi)，需用滅菌吸管反復(fù)吹吸50次?，F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室條件較好，為了防止產(chǎn)生有害的氣溶膠并且減少操作污染，一般建議使用旋渦混合儀來(lái)充分混勻稀釋液。



3．培養(yǎng)基的選擇：在霉菌和酵母計(jì)數(shù)中，主要使用以下幾種選擇性培養(yǎng)基。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。用PDA作平板計(jì)數(shù)時(shí)，必須加入抗菌素（國(guó)標(biāo)使用的是氯霉素）以抑制細(xì)菌。但是這個(gè)培養(yǎng)基上霉菌容易蔓延生長(zhǎng)，影響zui后的計(jì)數(shù)。

孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基：該培養(yǎng)基中的孟加拉紅可抑制霉菌菌落的蔓延生長(zhǎng)。孟加拉紅還在菌落背面由孟加拉紅產(chǎn)生的更深的紅色有助于霉菌和酵母菌落的計(jì)數(shù)。也需要加入抗菌素（國(guó)標(biāo)使用的是氯霉素）抑制細(xì)菌的干擾。

高鹽察氏培養(yǎng)基：糧食和食品中常見(jiàn)的曲霉和青霉在該培養(yǎng)基上分離效果良好，它具有抑制細(xì)菌和減緩生長(zhǎng)速度快的毛霉科菌種的作用?，F(xiàn)在于飼料霉菌檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)采用。



4．傾注培養(yǎng)：每個(gè)樣品應(yīng)選擇3個(gè)適宜的稀釋度，每個(gè)稀釋度分別取2個(gè)1 mL加入2個(gè)平皿。同時(shí)吸取1 mL無(wú)菌稀釋液加入一個(gè)無(wú)菌平皿作為空白對(duì)照。培養(yǎng)基融化后冷卻至46 ℃，立即傾注并旋轉(zhuǎn)使稀釋液與瓊脂混勻，先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，再轉(zhuǎn)向相反方向，充分混合均勻。培養(yǎng)基凝固后，把平皿正置于溫箱培養(yǎng)。大多數(shù)霉菌和酵母在中等溫度的條件下生長(zhǎng)良好，因此，美國(guó)FDA規(guī)定的培養(yǎng)溫度是25℃，我國(guó)規(guī)定的培養(yǎng)溫度是28 ℃。培養(yǎng)3 d后開(kāi)始觀察菌落生長(zhǎng)情況，共培養(yǎng)5 d。觀察第5天的計(jì)數(shù)結(jié)果，并記錄。如空白對(duì)照有菌落出現(xiàn)。此次試驗(yàn)無(wú)效。



5．菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告：選取菌落數(shù)10～150之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。固體檢樣以g為單位報(bào)告，液體檢樣以mL單位報(bào)告。關(guān)于稀釋倍數(shù)的選擇可參考細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定。



6．霉菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法：采用該方法，需要一片較為昂貴的霍華德霉菌計(jì)測(cè)片。沒(méi)有這個(gè)玻璃片，無(wú)法進(jìn)行這個(gè)直接鏡檢的方法。

該方法將果醬或果汁稀釋到一定波美度后，涂布在霍華德霉菌計(jì)測(cè)片上。然后在顯微鏡下觀察，觀察50個(gè)視野里面是否有霉菌。要求兩個(gè)人進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。以100個(gè)視野觀察結(jié)果報(bào)告。