如何正確使用明膠酶譜分析試劑盒

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明膠酶譜分析試劑盒使用注意事項(xiàng)：

1.制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡。

2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實(shí)驗(yàn)時盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因?yàn)闀淖兎跤旱腜H值，在普通孵箱即可。

明膠酶譜分析試劑盒檢測步驟：

1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。

4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。

6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

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使用信帆生物明膠酶譜法試劑盒發(fā)表的文章：

《綠茶多酚EGCG增強(qiáng)動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其相關(guān)機(jī)制研究》

*部分綠茶多酚EGCG增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目的:急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列嚴(yán)重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不穩(wěn)定型心絞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究資料已證實(shí),急性冠脈綜合征發(fā)病的zui主要病理生理基礎(chǔ)是冠狀動脈中不穩(wěn)定型動脈粥樣硬化斑塊的破裂,引起冠狀動脈內(nèi)急性血栓形成,繼而引起心肌嚴(yán)重的缺血、缺氧。近年來,多項(xiàng)流行病學(xué)研究報(bào)道稱,飲用綠茶可以明顯降低冠心病的發(fā)病率。綠茶的抗動脈粥樣硬化作用主要原因是綠茶中含有大量的多酚類化合物,其中含量zui多的為兒茶素。綠茶中兒茶素主要成分包括表兒茶素(EC),表兒茶素沒食子酸酯(ECG),表沒食子兒茶素(EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。在這些成分中,以EGCG含量zui豐富,活性zui強(qiáng),已被證明具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)特性。我們進(jìn)行本研究主要目的就是為了證實(shí)綠茶多酚EGCG是否能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。

方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周齡,體重18-20g)被隨機(jī)分為對照組(n=15)以及EGCG組(n=15)這些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)。EGCG組以及對照組分別給予EGCG(10mg/kg)或者同等劑量的0.9%生理鹽水進(jìn)行腹腔注射共16周。隨后麻醉處死小鼠,取小鼠頭臂干動脈并予固定石蠟包埋。小鼠頭臂干橫切面進(jìn)行HE染色以及Masson染色分別評估動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)以及膠原含量。此外,使用免疫組織化學(xué)染色的方法分析小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞成分的比例。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)用來檢測斑塊中蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法用來檢測斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。

MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-信帆生物

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