許多生物學(xué)樣本都是異質(zhì)的，比如干細(xì)胞培養(yǎng)物和腫瘤樣本，它們由不同的細(xì)胞類型組成。弄清這些樣本中細(xì)胞亞群的遺傳組成，有助于我們了解樣本的特性。不過，這并不是件輕松的事。在干細(xì)胞培養(yǎng)物中，多能細(xì)胞的周圍可能伴隨著分化細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。有時(shí)，多能細(xì)胞只占了一小部分。
專家認(rèn)為，若想從混合的培養(yǎng)物中獲得可靠的數(shù)據(jù)，zui有效的方法是先分選目的細(xì)胞，再開展測(cè)定。他們近日發(fā)布了一篇應(yīng)用指南，是通過結(jié)合細(xì)胞分選和數(shù)字PCR，來區(qū)分異質(zhì)樣本中的拷貝數(shù)變異。
首先，他們利用S3或S3e細(xì)胞分選儀，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)或熒光標(biāo)記對(duì)異質(zhì)群體進(jìn)行分選。在收集到純的樣本之后，他們?cè)倮肣X200微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）系統(tǒng)進(jìn)行深入鑒定。數(shù)字PCR技術(shù)將樣本分成納米大小的液滴，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行數(shù)萬(wàn)次獨(dú)立的測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)定量。
此次，他們研究的對(duì)象是拷貝數(shù)變異（CNV），即基因組中基因的擴(kuò)增或缺失，這在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及藥物代謝中起了重要作用。在人類基因組中，大約12%的區(qū)域是拷貝數(shù)可變的，而這些變異對(duì)表型的貢獻(xiàn)正被廣泛研究。不過，在腫瘤組織中，拷貝數(shù)可變的腫瘤細(xì)胞被正常的細(xì)胞所包圍，這增加了研究的難度。
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了HEK 293-GFP和ATCC HTB-70細(xì)胞系。前者是一種穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞系，每個(gè)基因組中包含一個(gè)拷貝的細(xì)胞周期蛋白D1基因（CCND1）（G1期有兩個(gè)）；而后者是一種黑色素瘤細(xì)胞系，不表達(dá)GFP，每個(gè)基因組中包含三個(gè)拷貝的CCND1（G1期有六個(gè)）。他們對(duì)不同比例的細(xì)胞混合物進(jìn)行了分選，之后提取出DNA，并利用Bio-Rad的PrimePCR ddPCR Copy Number Assay進(jìn)行了分析。
研究人員分選后，發(fā)現(xiàn)富集的HEK 293-GFP細(xì)胞純度達(dá)到99.36%，而HTB-70細(xì)胞更是達(dá)到了99.88%。之后，他們利用數(shù)字PCR確定了兩種細(xì)胞系中CCND1基因的拷貝數(shù)。與單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞系相同，分選出的HEK 293-GFP細(xì)胞有兩個(gè)拷貝，而分選出的HTB-70細(xì)胞有六個(gè)拷貝。然而，若是細(xì)胞混合物，比如HEK 293-GFP和HTB-70細(xì)胞以50:50的比例混合，拷貝數(shù)則為4.97。這表明對(duì)于異質(zhì)性的樣本，細(xì)胞分選能夠區(qū)分不同亞群，并明顯改善數(shù)字PCR的結(jié)果。

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