Western Blot實(shí)驗(yàn)應(yīng)該如何選擇合適的抗體

很多老師在做 實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不知道應(yīng)該如何來(lái)選擇正確的一抗和二抗，信帆生物為您答疑解惑。信帆生物專(zhuān)業(yè)提供 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)，PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)，免疫組化，免疫熒光檢測(cè)服務(wù)，放射免疫檢測(cè)服務(wù)，為您的實(shí)驗(yàn)助力！

首先要看你做的是什么物種，根據(jù)物種特異與否選擇單抗或者多抗。

一般小鼠、大鼠等常用模式動(dòng)物可以選擇鼠源單克隆抗體，其特異性較好，如果是不常見(jiàn)動(dòng)物模型，建議選擇多克隆抗體。

當(dāng)然，單抗或者多抗也不是一定的，需要去查詢抗原決定簇的歸屬，一般是找到抗體所對(duì)應(yīng)的特異氨基酸序列，到數(shù)據(jù)庫(kù)與你要做的物種進(jìn)行比對(duì)，如果匹配度較高（85%以上），則建議購(gòu)買(mǎi)嘗試。

二抗的選擇相對(duì)就簡(jiǎn)單了，根據(jù)一抗的種屬特異性進(jìn)行二抗選擇即可。

如一抗選用鼠源（Mouse）抗體，則二抗選用抗小鼠抗體即可（e.g. Goat Anti-Mouse），注意二抗的反應(yīng)特性（熒光、HRP偶聯(lián)等）

其次就是多查閱文獻(xiàn)，查看和 Western Blot 實(shí)驗(yàn)相關(guān)的 SCI 文獻(xiàn)，查看要做的種屬和指標(biāo)關(guān)聯(lián)度高的文獻(xiàn)。

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抗體分類(lèi)：根據(jù)重鏈恒定區(qū)的血清學(xué)類(lèi)型，可將抗體分為 IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五類(lèi)，它們的重鏈分別為 mu, gamma, alpha, delta, epsilon 鏈。在上述每一類(lèi)別中，按重鏈構(gòu)造上的變異又可分為幾個(gè)亞類(lèi)，例如人的 IgG 可分為 IgG1，IgG2，IgG3，IgG4 四個(gè)亞類(lèi)。 輕鏈分為兩種類(lèi)型，kappa鏈和lambda鏈，但每種抗體中只存在一種類(lèi)型的輕鏈。 二抗：二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛，如 western blot（通過(guò)與特異性抗體結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)），ELISA（以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體），免疫組織化學(xué)（檢測(cè)組織中的特異性抗原），免疫細(xì)胞化學(xué)（通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的抗原組成），流式細(xì)胞術(shù)（通過(guò)檢測(cè)激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類(lèi)型的細(xì)胞）及免疫沉淀（通過(guò)抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來(lái)分離相應(yīng)抗原）。二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。

二，如何選擇二抗——根據(jù)一抗種屬及類(lèi)型選擇合適的二抗

廣義上是指專(zhuān)門(mén)和進(jìn)行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體，在免疫學(xué)反應(yīng)中，經(jīng)常需要針對(duì)試驗(yàn)選擇不同的二抗，信帆生物科技有限公司為您的科研工作提供適合和全面的二抗產(chǎn)品。檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測(cè)方案，因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類(lèi)型及后繼檢測(cè)方案的要求，一般來(lái)說(shuō)，選擇合適的二抗需要從下面幾個(gè)方面考慮：【一抗的種屬來(lái)源】

二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來(lái)源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。

二抗需與一抗的類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配。這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類(lèi)免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗 IgG 抗體。其中單克隆抗體的類(lèi)別及亞類(lèi)通常會(huì)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中都會(huì)有描述，如果你的一抗是小鼠 IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠 IgM。如果單克隆一抗是小鼠 IgG 的某一亞類(lèi)（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎的抗小鼠 IgG 都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專(zhuān)門(mén)針對(duì)這一亞類(lèi)的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠 IgG1，那么你可以選擇抗IgG1 的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類(lèi)/亞類(lèi)的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種 IgG。

一般來(lái)說(shuō)，不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的聯(lián)系，來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒(méi)有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的，一個(gè)是小鼠來(lái)源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。有相應(yīng)的驢來(lái)源的二抗，非常適合做類(lèi)似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)?！径沟鸟盥?lián)標(biāo)記】

一般來(lái)講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶 HRP 和堿性磷酸酶 AP 或其衍生物，PAP），熒光基團(tuán)（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight 等）金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于 Western Blot 和 ELISA，常用的二抗是酶標(biāo)二抗；而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用 Biotin/Avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。

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